Lowry-Test

Die Proteinbestimmung nach Lowry ist eine Methode, um Proteine quantitativ zu bestimmen.[1]

Sie beruht auf zwei Reaktionen:

  • Der erste Schritt beruht auf der Biuretreaktion, nämlich auf der Bildung eines blau-violetten, quadratisch-planaren Komplexes zwischen den Peptidbindungen und den Kupfer(II)-Ionen in alkalischer Lösung.
  • In einem zweiten Schritt wird Cu(II) zu Cu(I) reduziert. Dieses Cu(I) wiederum reduziert das gelbe Folin-Ciocalteu Reagenz (Molybdän(VI)- und Wolfram(VI)-Heteropolysäuren) zu Molybdänblau. Die resultierende intensive Blaufärbung wird zur quantitativen Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Photometrie bei 750 nm, 650 nm oder 540 nm vermessen. [2]

Die Lowry-Methode ist wesentlich empfindlicher als die Biuret-Methode wegen ihrer zweiten, zusätzlichen Farbreaktion. Es können auch Proteinkonzentrationen von 0,1–1 µg Protein pro Milliliter bestimmt werden 1–10.[2] Allerdings ist sie zeitaufwändiger und störanfälliger. So wird diese von nicht-proteinogenen Substanzen sowie von EDTA, Triton X-100 oder Ammoniumsulfat gestört.[2]

In der Literatur sind einige Verbesserungen und Weiterentwicklungen beschrieben worden. So hat Hartree 1972 eine Variante der Lowry-Methode vorgestellt, die u. a. die hohe Störanfälligkeit adressiert.[3] Bezüglich der Zeitentwicklung der Blaufärbung nach Zugabe des Folin-Ciocalteu-Reagenz empfahl Lowry eine Wartezeit von 30 Minuten und dann die Extinktion bei 750 Nanometer zu messen. Eine aktuelle Untersuchung von Christopher Pomory zeigt jedoch, dass die Intensität der Blaufärbung im Zeitraum zwischen 30 und 120 Minuten noch zunimmt, zwischen 120 und 240 Minuten stabil bleibt und anschließend wieder abnimmt.[4] Darüber hinaus empfehle es sich die Lowry-Reagenzien mit Wasser statt mit Natriumhydroxid anzusetzen, dagegen die Proteinlösungen in 1 M Natriumhydroxid. Weiterhin seien zur Messung der Extinktion 660 Nanometer geeigneter als die üblichen 750 Nanometer.

Als Alternative bietet sich die einfachere Proteinbestimmung nach Bradford an, die ähnlich empfindlich ist. Der Vorteil der Lowry-Methode gegenüber der Methode nach Bradford ist, dass mit ihr auch Proteinkonzentrationen in Lösungen bestimmt werden können, die Natriumlaurylsulfat (SDS) enthalten, welches die Bestimmung nach Bradford behindern würde.[5] Alternativ kann man auch das Cu(I) mittels Bicinchoninsäure (BCA) in einen intensiv-rosa Komplex umwandeln, der photometrisch bestimmt wird.[6]

Trivia

Aufgrund der weiten Verbreitung dieses Verfahrens handelt es sich bis 2005 bei der aufgeführten Publikation von Oliver Lowry[1] um die am häufigsten zitierte überhaupt.[7]

Quellenangaben

  1. a b Oliver H. Lowry et al.: Protein measurement with the Folin phenol reagent. In: J. Biol. Chem. Band 193, Nr. 1, 1951, S. 265–275. PMID 14907713 PDF
  2. a b c F. Lottspeich (Hrsg.), J. W. Engels (Hrsg.) und A. Simeon (Hrsg.): Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, 2. Auflage, 2006, ISBN 3-8274-1520-9; S.38
  3. E. F. Hartree: Determination of protein. A modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. In: Anal. Biochem. Band 48, 1972, S. 422–427. PMID 4115981 doi:10.1016/0003-2697(72)90094-2
  4. Christopher Pomory: Color development time of the Lowry protein assay. In: Anal. Biochem. Band 378, Nr. 2, 2008, S. 216–217. PMID 18448065 doi:10.1016/j.ab.2008.04.015
  5. J. R. Dulley und P. A. Grieve: A simple technique for eliminating interference by detergents in the Lowry method of protein Determination. In: Anal Biochem. Band 64, Nr. 1, 1975, S. 136–141. PMID 1137083 doi:10.1016/0003-2697(75)90415-7
  6. P. K. Smith et al.: Measurement of protein using bicinchoninic acid. In: Anal. Biochem. Band 150, Nr. 1, 1985, S. 76–85. PMID 3843705 doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
  7. Hubert Rehm: Einfach und doch so kompliziert. Laborjournal Heft 7-8 2008, S. 38

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